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Project: Papel de las proteínas involucradas en la polimerización de los microtúbulos en el crecimiento polarizado en Neurospora crassa 
Responsable: Rosa Reyna  Mouriño  Pérez
Tipo de proyecto: Proyecto Conacyt
Resumen: Este proyecto es la continuación del estudio (Ciencias Básicas 2003) sobre la dinámica del citoesqueleto microtubular y la localización de los centros organizadores de microtúbulos (Mts) en hongos filamentosos (SEP-2003-CO2-44724), además de otro proyecto sobre el estudio in vivo de las proteínas involucradas en la polimerización de los Mts y su importancia en el crecimiento polarizado en Neurospora crassa (SEP-2007-82753).
La idea de este proyecto es analizar integralmente la dinámica de los Mts, estudiando tanto las proteínas asociadas a la terminal negativa como a la positiva, para poder describir como es formado un Mt de novo, y como es regulado posteriormente en su terminal positva por diferentes MAPs. Y entender su contribución en el crecimiento polarizado del hongo filamentoso N. crassa.
Hemos demostrado que en N. crassa hay nucleación de Mts en ausencia de g-tubulina, aunque este proceso se da espontáneamente in vitro, necesita asistencia dentro de la célula. Se desconocen que elementos participan en la nucleación de los Mts en sitios alternos a los cuerpos polares de los núcleos y que actúan como MTOCs. Después de una búsqueda exhaustiva, se encontró que las proteínas ApsA y ApsB de A. nidulas tienen papel nucleador y organizador de Mts, por lo que se buscaron sus homólogos en N. crassa para estudiar su relación con los Mts en este organismo. Se encontró a la proteína hipotética NCU01953.3 homóloga a ApsA, denominada como MTB-6, esta parece ser un buen candidato para brindar soporte a los Mts citoplasmáticos anclándolos a la membrana celular y también la proteína hipotética NCU02411.3 homóloga a ApsB denominada como MTB-7 que puede ser la responsable de la nucleación y organización de Mts a partir de MTOCs alternos a los cuerpos polares de los núcleos.
Asimismo, es importante complementar el estudio de la dinámica celular y función de las TIP+ estudiadas con anterioridad, MTB-3, Lis1-1 y Lis1-2, que tienen un papel diferente y tal vez complementario en la regulación de la terminal positiva de los Mts, que incluye la inestabilidad dinámica y su contribución en el crecimiento polarizado de los hongos filamentosos, así como la caracterización de sus mutantes. El caso particular de Lis1-1 y Lis1-2 es muy interesante porque N. crassa es uno de los pocos organismos que tiene duplicada esta proteína.
Es importante mencionar que la realización de este proyecto plantea observaciones a tres niveles, estructural, molecular y bioquímico. El grupo conformado para la realización de este trabajo garantiza una amplia experiencia en cada uno de estos niveles. Para realizar este estudio contamos con el TODO el equipo y la experiencia en microscopia confocal de alta resolución y nos auxiliaremos con una técnica llamada microscopia de reflexión interna total de la fluorescencia (TIRFM en inglés) con la cual ya hemos tenido una experiencia favorable, esta técnica es crítica para observar la dinámica de proteínas en la corteza celular. Así como la microscopia electrónica de trasmisión para describir ultraestructuras.
Para estudiar la localización de MTB-3, lis1-1, lis1-2, MTB-6 y MTB-7 se marcaran con proteínas fluorescentes (FP) que emitan en colores diferentes GFP (verde) y mcherryFP, (las tres primeras ya han sido marcadas). De cada una se realizará microscopia confocal y TIRFM. Las asociaciones entre las proteínas estudiadas se estudiarán en cepas con dobles marcajes, cada con una FP diferente, se podrá ver si hay colocalización entre las proteínas de la terminal positiva por un lado y las de la terminal negativa el otro. Además, se realizaran dobles marcajes en la cepa que tiene los Mts marcados para identificar la relación espacial que cada una tiene con los Mts. Se obtendrán mutantes sencillas de cada proteínas de interés (MTB-3, Lis1-1, Lis1-2, MTB-6 y MTB-7), y se caracterizaran fenotípicamente para dilucidar sus funciones. También se realizara la doble mutante de Lis1-1 Lis1-2. En cada una de las mutantes se marcaran los Mts p
Vigencia: (2011-04-12 - 2014-04-12)

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